細(xì)胞質(zhì)染色是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中用于觀察細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)、成分分布及代謝活動(dòng)的重要技術(shù)。其核心在于通過特定染色劑與細(xì)胞質(zhì)中的目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合，在顯微鏡下呈現(xiàn)清晰可見的圖像。以下是細(xì)胞質(zhì)染色的標(biāo)準(zhǔn)流程及關(guān)鍵要點(diǎn)：
一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1. 材料選擇
- 細(xì)胞類型：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適細(xì)胞，如動(dòng)植物細(xì)胞(如洋蔥表皮細(xì)胞、人口腔上皮細(xì)胞)、培養(yǎng)細(xì)胞或微生物(如酵母菌)。
- 染色目標(biāo)：明確需觀察的細(xì)胞質(zhì)成分(如線粒體、液泡、糖原顆粒等)，選擇對(duì)應(yīng)的特異性染色劑。
2. 試劑與儀器
- 染色劑：
- 活體染色劑：如詹納斯綠B(線粒體專一性染色)、中性紅(液泡染色)。
- 固定染色劑：如蘇丹染料(脂質(zhì)檢測(cè))、碘液(淀粉檢測(cè))。
- 輔助試劑：生理鹽水(維持細(xì)胞形態(tài))、緩沖液(調(diào)節(jié)pH)、酒精(脫色或固定)。
- 工具：光學(xué)顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、滴管、染色皿、吸水紙等。
二、樣本制備
1. 細(xì)胞分離與處理
- 動(dòng)植物細(xì)胞：
- 動(dòng)物細(xì)胞：取口腔上皮細(xì)胞時(shí)，需用牙簽輕刮頰內(nèi)側(cè)，涂于載玻片生理鹽水中；若為血液細(xì)胞，需抗凝處理后離心分離。
- 植物細(xì)胞：撕取洋蔥內(nèi)表皮或葉片下表皮，剪成小片置于載玻片上。
- 微生物：酵母菌懸液需稀釋至適宜濃度(如10%葡萄糖培養(yǎng)液中培養(yǎng))。
2. 細(xì)胞活性維持
- 活體染色需保持細(xì)胞活性，操作需迅速，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
- 若需固定細(xì)胞(如死細(xì)胞染色)，用95%酒精或醋酸-酒精混合液(3:1)固定10-15分鐘，水洗后染色。
三、染色操作
1. 染色劑配制
- 詹納斯綠B染液：1%詹納斯綠B溶于生理鹽水，現(xiàn)用現(xiàn)配(易沉淀)；
- 中性紅染液：0.1%中性紅水溶液，用于液泡活體染色；
- 蘇丹染液：蘇丹III或IV溶于酒精，用于脂滴檢測(cè)(需切片脫色)。
2. 染色步驟
- 活體染色(以線粒體為例)：
1. 載玻片中央滴加1-2滴詹納斯綠B染液；
2. 放置細(xì)胞樣本，覆蓋蓋玻片，避免氣泡；
3. 室溫染色10-15分鐘，顯微鏡下觀察線粒體藍(lán)綠色顆粒。
- 固定染色(以脂滴為例)：
1. 細(xì)胞樣本經(jīng)酒精固定后，水洗去除殘留酒精；
2. 蘇丹染液染色15分鐘，酒精分色(洗去多余染料)；
3. 水洗后甘油封片，鏡下觀察橘紅色脂滴。
3. 染色條件控制
- 時(shí)間：活體染色時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，染色劑滲漏；固定染色需充分反應(yīng)。
- 濃度：染色劑濃度過高易導(dǎo)致背景過深，需按標(biāo)準(zhǔn)稀釋(如0.5%-1%溶液)。
- 溫度：常溫操作，高溫可能破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或加速染料揮發(fā)。
四、封片與觀察
1. 封片處理
- 活體染色樣本直接蓋蓋玻片，吸去多余染液；
- 固定染色樣本需梯度脫水(酒精系列)后，用中性樹脂或甘油封片。
2. 顯微鏡觀察
- 低倍鏡定位：快速找到染色區(qū)域，調(diào)整光強(qiáng)(活體染色需弱光避免漂白)。
- 高倍鏡細(xì)節(jié)：切換高倍物鏡，調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，觀察細(xì)胞器形態(tài)、分布及顏色。
- 對(duì)照設(shè)置：設(shè)置未染色對(duì)照組，排除非特異性著色干擾。
五、結(jié)果分析與記錄
1. 圖像特征
- 線粒體：詹納斯綠B染色后呈藍(lán)綠色棒狀或顆粒狀；
- 液泡：中性紅染色后呈紅色，占據(jù)細(xì)胞大部分體積；
- 脂滴：蘇丹染色后呈橘紅色圓形顆粒。
2. 數(shù)據(jù)記錄
- 繪圖標(biāo)注細(xì)胞器位置、大小及數(shù)量；
- 記錄染色條件(時(shí)間、濃度)、細(xì)胞活性狀態(tài)及異?，F(xiàn)象(如質(zhì)膜破裂導(dǎo)致染料外滲)。
六、注意事項(xiàng)
1. 安全操作：染色劑多為有毒化學(xué)品(如苯胺類)，避免皮膚接觸，實(shí)驗(yàn)后洗手。
2. 污染控制：染色廢液需分類回收，避免交叉污染其他樣本。
3. 誤差排查：
- 背景過深：縮短染色時(shí)間或降低染液濃度；
- 細(xì)胞重疊：重新制片，確保單層分布。
