內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色試劑盒的使用細節(jié)需根據(jù)具體試劑類型和實驗需求進行調(diào)整，以下結合不同試劑盒的特點及操作要點進行詳細說明：
一、試劑準備與工作液配制
1. 染料特性與分裝：
- 常用探針如E01(藍色熒光，Ex/Em=373/430nm)、ER Green(綠色熒光，Ex/Em=490/520nm)或ER示蹤劑&8482;紅(紅色熒光，Ex/Em=589/620nm)，需根據(jù)實驗需求選擇。
- 染料母液通常為DMSO溶液，需避免反復凍融。建議使用時分裝為小管，每管一次性使用，長期保存需-20℃避光。
2. 工作液稀釋：
- 初始稀釋：用染料稀釋液將母液稀釋10倍，再用HBSS緩沖液或培養(yǎng)基進一步稀釋50-500倍(貼壁細胞)或20-100倍(需固定/透化的樣本)。
- 濃度優(yōu)化：最終工作濃度需根據(jù)細胞類型預實驗確定，原則是“至低有效濃度”，避免背景干擾和細胞毒性。
二、細胞染色流程
1. 貼壁細胞染色：
- 預處理：棄去培養(yǎng)基，用HBSS緩沖液輕洗細胞1次，移除殘留血清或酚紅(可能干擾熒光)。
- 孵育：加入預熱的染色工作液(37℃)，覆蓋細胞即可。孵育時間15-40分鐘，需避光操作。
- 清洗：吸除染液，用新鮮培養(yǎng)基或HBSS洗滌3次，去除游離探針。
2. 懸浮細胞染色：
- 重懸染色：離心棄上清，用預熱的染色工作液重懸細胞，37℃孵育15-40分鐘[。
- 貼壁輔助：可選多聚賴氨酸處理蓋玻片，使細胞貼附后染色，后續(xù)操作同貼壁細胞。
三、固定與透化(可選)
1. 固定：
- 用含2-4%甲醛的HBSS或培養(yǎng)基固定細胞10分鐘，室溫或37℃均可。固定后熒光信號可能部分衰減，需優(yōu)化固定條件。
2. 透化：
- 去污劑法：0.2% Triton X-100的PBS孵育10分鐘，適用于免疫染色(ICC)前處理。
- 丙酮法：預冷丙酮透化5分鐘，可降低背景信號，但可能破壞部分膜結構。
四、觀察與數(shù)據(jù)采集
1. 濾光片選擇：
- 根據(jù)探針調(diào)整顯微鏡濾光片，如FITC通道(綠色)、德州紅通道(紅色)或自定義波段。
2. 活細胞與固定細胞差異：
- 活細胞染色需快速操作，避免長時間暴露導致探針泄漏；固定細胞可延長觀察時間，但需平衡固定造成的信號損失。
五、關鍵注意事項
1. 操作細節(jié)：
- DMSO母液冬季易凝固，需預熱至室溫并離心回收液體，吸頭需預熱防止染料吸附。
- 避光操作：探針對光敏感，染色及洗滌過程需盡量減少光照。
2. 兼容性與污染控制：
- 避免與其他品牌試劑混用，防止交叉污染。
- 使用一次性耗材，玻璃器皿需清洗并去除殘留清潔劑。
3. 實驗優(yōu)化：
- 濃度與時間：不同細胞膜通透性差異大(如腫瘤細胞vs原代細胞)，需預實驗調(diào)整染色條件。
- 多色染色：可搭配其他熒光標記(如F-actin綠色、細胞核藍色)，但需驗證探針光譜重疊性。
六、常見問題與解決方案
1. 背景過高：
- 降低探針濃度或縮短孵育時間。
- 增加洗滌次數(shù)或改用低吸附耗材。
2. 染色不均：
- 確保工作液覆蓋均勻，懸浮細胞需輕柔混勻。
- 貼壁細胞可延長孵育時間至30分鐘。
3. 熒光衰減：
- 固定后信號減弱屬正?，F(xiàn)象，可通過延長成像時間或提高激發(fā)強度補償。
